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RNAiMAX轉(zhuǎn)染的主要途徑探討

發(fā)布時(shí)間： 2022-04-11　　點(diǎn)擊次數(shù)： 2605次

　　RNAiMAX轉(zhuǎn)染是指將外源分子RNA導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)，它是研究基因表達(dá)調(diào)控，突變分析等的常規(guī)工具。細(xì)胞轉(zhuǎn)染可分瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染是指外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞后，存在于游離的載體上，不整合到細(xì)胞的染色體上。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是指DNA整合到宿主細(xì)胞的染色體中。
　　RNAiMAX轉(zhuǎn)染的一般途徑如下：
　　一、物理介導(dǎo)
　　1.電穿孔法
　　電穿孔靠脈沖電流在細(xì)胞膜上打孔而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。本法需用特殊設(shè)置（電穿孔儀），把懸浮狀態(tài)的受體細(xì)胞和供體RNA共同放入皿中（或杯中），再施以高壓電脈沖，能夠促進(jìn)RNA通過(guò)細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)，并可整合到細(xì)胞的RNA中，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。若轉(zhuǎn)移的RNA為帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行鑒定。
　　2.顯微注射
　　本法是借助顯微注射器直接把RNA注射入核內(nèi)，使之發(fā)生整合入受體細(xì)胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴(yán)密無(wú)菌的凈化室，以免敞開(kāi)操作污染，同時(shí)要能有自動(dòng)拉針儀以制備顯微針，一般用手動(dòng)拉針器拉制時(shí)要能使針末端有一個(gè)0.6cm長(zhǎng)的細(xì)部，太長(zhǎng)易折斷，針尖開(kāi)口為2-3μm間，針口小于1μm更佳，針尖開(kāi)口大于5μm易刺傷細(xì)胞。
　　3.基因槍
　　基因槍依靠攜帶了核酸的高速粒子而將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。可以將大分子導(dǎo)入細(xì)胞。
　　二、化學(xué)介導(dǎo)
　　1.磷酸鈣共沉淀法
　　磷酸鈣被認(rèn)為有利于促進(jìn)外源RNA與靶細(xì)胞表面的結(jié)合。氯化鈣+RNA+磷酸緩沖液按一定的比例混合，形成極小的磷酸鈣-RNA復(fù)合物沉淀黏附在細(xì)胞膜表面，借助內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。沉淀顆粒的大小和質(zhì)量對(duì)于轉(zhuǎn)染的成功至關(guān)重要。
　　2.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染
　　中性脂質(zhì)體是利用脂質(zhì)膜包裹RNA，借助脂質(zhì)膜將RNA導(dǎo)入細(xì)胞膜內(nèi)。帶正電的陽(yáng)離子脂質(zhì)體則不同，RNA并沒(méi)有欲先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負(fù)電的RNA自動(dòng)結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成RNA-陽(yáng)離子脂質(zhì)體復(fù)合物，從而吸附到帶負(fù)電的細(xì)胞膜表面，經(jīng)過(guò)內(nèi)吞被導(dǎo)入細(xì)胞。
　　3.多種陽(yáng)離子物質(zhì)介導(dǎo)
　　DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，原理可能是通過(guò)內(nèi)吞噬作用而使RNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。不適用與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染時(shí)要除去血清。
　　三、生物介導(dǎo)
　　病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，以病毒作為載體，通過(guò)病毒感染的方式將外源RNA導(dǎo)入到細(xì)胞中，其中以逆轉(zhuǎn)錄病毒及腺病毒轉(zhuǎn)染體系常用。

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