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    小鼠胚胎MEF細胞的提取

    發(fā)布時間: 2023-01-06  點擊次數(shù): 1601次

    小鼠胚胎MEF細胞的提取步驟:

    1.將新鮮收獲的胚胎放入10厘米的細胞培養(yǎng)皿中

    2.用PBSA覆蓋胚胎,取出胎盤和其他母體組織

    3.切掉頭頂(眼睛及以上),取出內臟

    4.保存頭部/卵黃囊進行DNA分離以進行基因分型檢測

    5.將胚胎體置于單獨的10厘米板中

    6.加入1mL胰蛋白酶,用刀片切碎成1mm的小碎片

    7.用酒精燈火焰對樣品之間的刀片進行消毒

    8.將皿置于37°C培養(yǎng)箱中30-45分鐘(傾斜,使胰蛋白酶覆蓋細胞)

    9.通過在每口井中添加4mL MEF培養(yǎng)基(通常DMEM+10%FBS+1%G/A)來抑制typsin活性。

    10.用移液管10-20x吹打分離組織

    11將細胞懸浮液轉移到T75燒瓶或10cm平板上,并添加6-15mL MEF培養(yǎng)基

    12.讓細胞生長融合(3-4天)

    13.抽出培養(yǎng)基,用10mL PBS沖洗

    14.加入3mL胰蛋白酶,在37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5-10min

    15.加入7mL MEF培養(yǎng)基進行中和

    16.用移液管吸至離心管離心,使細胞重新懸浮

    17.將懸浮液轉移到2個T175燒瓶中,并向每個培養(yǎng)瓶中添加50mL MEF培養(yǎng)基

    18.讓細胞生長融合(3-4天)

    19通過胰蛋白酶消化收獲細胞,冷凍細胞@3x106細胞/瓶,注意冷凍不能密度太稀,此細胞凍存后復蘇的存活會大量減少。

     

    備注:1.在細胞培養(yǎng)房中執(zhí)行細胞分離,并注意無菌操作,

          

    2. 建議使用含有血清的凍存液凍存。


    3. 原代分離培養(yǎng)請使用慶大霉素/兩性霉素溶液來防止細胞污染發(fā)生。

     

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